Mengisolasi klon
Secara umum, kloning dilakukan untuk mendapatkan klon dari satu gen atau urutan DNA tertentu. Karena itu, langkah selanjutnya setelah kloning adalah menemukan dan mengisolasi klon itu di antara anggota perpustakaan lainnya. Jika perpustakaan mencakup seluruh genom suatu organisme, maka suatu tempat di dalam perpustakaan itu akan menjadi klon yang diinginkan. Ada beberapa cara untuk menemukannya, tergantung pada gen spesifik yang bersangkutan. Paling umum, segmen DNA yang dikloning yang menunjukkan homologi ke gen yang dicari digunakan sebagai penyelidikan. Sebagai contoh, jika gen tikus sudah dikloning, maka klon itu dapat digunakan untuk menemukan klon manusia yang setara dari perpustakaan genom manusia. Koloni bakteri yang membentuk perpustakaan ditanam dalam koleksi hidangan Petri. Kemudian membran berpori diletakkan di atas permukaan setiap lempeng, dan sel-sel menempel pada membran. Sel-sel pecah, dan DNA dipisahkan menjadi untaian tunggal — semua pada membran. Probe juga dipisahkan menjadi untaian tunggal dan diberi label, seringkali dengan fosfor radioaktif. Suatu larutan probe radioaktif kemudian digunakan untuk membasuh membran. DNA probe beruntai tunggal hanya akan menempel pada DNA klon yang mengandung gen setara. Membran dikeringkan dan ditempatkan pada selembar film yang peka terhadap radiasi, dan di suatu tempat pada film tersebut akan muncul bintik hitam, yang mengumumkan keberadaan dan lokasi klon yang diinginkan. Klon kemudian dapat diambil dari cawan Petri asli.
genetika: Teknologi DNA rekombinan dan reaksi berantai polimerase
Kemajuan teknis telah memainkan peran penting dalam memajukan pemahaman genetik. Pada tahun 1970 ahli mikrobiologi Amerika Daniel Nathans
Pengurutan DNA
Setelah segmen DNA dikloning, urutan nukleotida-nya dapat ditentukan. Urutan nukleotida adalah tingkat paling mendasar dari pengetahuan gen atau genom. Ini adalah cetak biru yang berisi instruksi untuk membangun suatu organisme, dan tidak ada pemahaman tentang fungsi genetik atau evolusi yang bisa lengkap tanpa mendapatkan informasi ini.
Penggunaan
Pengetahuan tentang urutan segmen DNA memiliki banyak kegunaan, dan beberapa contoh mengikuti. Pertama, dapat digunakan untuk menemukan gen, segmen DNA yang mengkode protein atau fenotipe tertentu. Jika suatu wilayah DNA telah diurutkan, itu dapat disaring untuk fitur karakteristik gen. Sebagai contoh, open reading frames (ORFs) —panjang urutan yang dimulai dengan kodon awal (tiga nukleotida yang berdekatan; urutan kodon menentukan produksi asam amino) dan tidak terganggu oleh kodon berhenti (kecuali satu pada penghentian mereka) —sarankan a daerah pengkode protein Juga, gen manusia umumnya berdekatan dengan apa yang disebut kepulauan CpG — gugus sitosin dan guanin, dua nukleotida yang membentuk DNA. Jika gen dengan fenotipe yang diketahui (seperti gen penyakit pada manusia) diketahui berada di wilayah kromosom yang diurutkan, maka gen yang tidak ditugaskan di wilayah tersebut akan menjadi kandidat untuk fungsi tersebut. Kedua, sekuens DNA homolog dari organisme yang berbeda dapat dibandingkan untuk merencanakan hubungan evolusi baik di dalam maupun di antara spesies. Ketiga, sekuens gen dapat disaring untuk daerah fungsional. Untuk menentukan fungsi gen, berbagai domain dapat diidentifikasi yang umum untuk protein dengan fungsi yang sama. Sebagai contoh, sekuens asam amino tertentu dalam gen selalu ditemukan dalam protein yang menjangkau membran sel; peregangan asam amino tersebut disebut domain transmembran. Jika domain transmembran ditemukan dalam gen fungsi yang tidak diketahui, itu menunjukkan bahwa protein yang dikodekan terletak di membran seluler. Domain lain mencirikan protein pengikat DNA. Beberapa database publik dari sekuens DNA tersedia untuk analisis oleh setiap individu yang tertarik.
